Vụ mưu sát Coligny là biến cố khởi phát cuộc khủng hoảng dẫn đến vụ thảm sát. Đô đốc Coligny là nhà lãnh đạo Huguenot được kính trọng nhất. E sợ những bất ổn khởi phát từ phe Kháng Cách, nhà vua và triều đình đến thăm Coligny đang trên giường bệnh và hứa trừng phạt thủ phạm. Trong khi Thái hậu đang dùng bữa tối, những người Kháng Cách đòi hỏi công lý. Do lo ngại người Kháng Cách bị trả đũa, em rể của Coligny đem 4000 quân thiện chiến đến đóng bên ngoài Paris[2] và, mặc dù không có dấu hiệu nào chứng tỏ sẽ bị tấn công, người Công giáo lo sợ sẽ có sự trả thù trên nhà Guise và dân thành Paris. Ngay đêm đó, Catherine có một buổi họp tại lâu đài Tuleries với các cố vấn người Ý của bà và Nam tước de Retz.

Đêm 23 tháng 8, Catherine đến gặp nhà vua để bàn về cuộc khủng hoảng. Dù không còn chi tiết nào được giữ lại đến ngày nay, Charles IX và mẹ đã quyết định thanh trừng các nhà lãnh đạo Kháng cách, ngoại trừ những ông hoàng cùng huyết thống như Henri xứ Navarre và Hoàng tử Condé. Theo những câu chuyện kể, nhà vua nói: "Được rồi, hãy làm như thế! Giết chúng đi! Giết tất cả bọn chúng! Đừng để một tên nào còn sống mà làm phiền đến ta!".

Ngay sau đó, chính quyền thành phố Paris được triệu tập, nhận lệnh đóng các cổng thành và vũ trang người dân để ngăn chặn bất cứ âm mưu nổi dậy nào. Đội vệ binh Thụy Sĩ của nhà vua được giao nhiệm vụ giết những lãnh tụ Kháng cách có tên trong danh sách. Ngày nay khó mà xác định trình tự của các biến cố và biết chính xác thời điểm vụ tàn sát bắt đầu. Có lẽ dấu hiệu hành động là một hồi chuông đổ vào khoảnh khoắc giữa nửa đêm và hừng đông từ nhà thờ Saint-Germain-l’Auxerrois, gần cung điện Louvre, là nhà thờ giáo xứ của vua chúa Pháp. Trước đó, đội vệ binh Thuỵ Sĩ đã lôi những nhà quý tộc Kháng Cách ra khỏi điện Louvre và bắt đầu tàn sát họ trên đường phố. Đô đốc Coligny bị kéo khỏi giường bởi chính Công tước Henry de Guise, bị sát hại và thi thể của ông bị ném qua cửa sổ. Tình trạng căng thẳng âm ỉ kể từ Hòa ước Saint-Germain nay bùng nổ dữ dội để trở thành làn sóng bạo động lan ra cùng khắp. Người dân Paris bắt đầu săn đuổi người Kháng Cách khắp mọi nơi trong thành phố. Sự tàn bạo của cuộc tàn sát diễn ra theo cung cách không thể tin nổi. Dây xích được giăng ra trên đường phố để người Kháng Cách không thể trốn thoát khỏi nhà họ. Phụ nữ và trẻ em bị đâm chém cách lạnh lùng. Cuộc tàn sát kéo dài trong vài ngày bất kể những nỗ lực của nhà vua nhằm chấm dứt nó. Trong số những người bị giết có nhà soạn nhạc Claude Goudimel và triết gia Petrus Ramus.

Từ tháng 8 đến tháng 10, các vụ thảm sát tương tự bùng nổ tại những nơi khác như Toulouse, Bordeaux, Lyon, Bourges, Rouen và Orléans. Không thể biết chính xác con số nạn nhân, nhưng những ước tính cho rằng có khoảng từ 2.000 đến 100.000 người bị giết[3]. Gần đây, một số sử gia ước tính có khoảng 2.000 người thiệt mạng ở Paris, và từ 5.000 đến 10.000 người ở những nơi khác trên nước Pháp.